La costituzione della potenza marittima spagnola fu analoga a quella turca: è del 1501-3 la conquista di Napoli e del 1509 la sottrazione dei porti della Puglia alla Serenissima. Carlo d'Asburgo, divenuto imperatore nel 1509 con il nome di Carlo V, fu in grado di condurre contro Tunisi, nel 1535, la più grande flotta che mai il Mediterraneo avesse visto. Di fronte al costituirsi e all'irrobustirsi di queste due potenze Venezia persegue un'accorta politica diplomatica, una ricerca di un equilibrio assai difficile, soprattutto dopo che nel 1527, con il sacco di Roma, Carlo V era divenuto il signore incontrastato della Penisola. Nel 1537-40 e nel 1570-73 Venezia è alleata degli Asburgo nelle leghe crociate condotte contro il Turco da Carlo V e da suo figlio, e successore, Filippo II. Nella prima delle due guerre la flotta cristiana del genovese Andrea Doria subisce una grave sconfitta a Prevesa . L'inaffidabilità del comandante e la chiara intenzione di Carlo di non voler rafforzare la posizione di Venezia in Grecia, costringono la Serenissima a stipulare una pace separata nel 1540. La conclusione della guerra mina il prestigio internazionale di Venezia a causa dei continui saccheggi operati dai turchi, e dall'eliminazione di ogni residuo dominio dei nobili veneziani sulle isole dell'Egeo a nord di Creta.